大规模细胞培养工艺的强化：N-1灌流
来自瑞士Merch Serono SA的科研人员在2018年第22期的《Current Opinion in Chemical Engineering》杂志上发表了题为“Intensification of larger-scale cell cultureprocesses”的文章。文中，作者指出重组蛋白生产经常会面临需使用现有的大规模生产能力满足市场需求的挑战，对于补料分批工艺，最大产能等于每个批次的产量乘以每年能完成的运行次数，所以，很大程度上取决于每个补料分批运行的持续时间，所以，文章将关注点转移到使用高接种密度开始补料分批，降低补料分批持续时间的策略，这是一种提高生产能力、且不需要对生产生物反应器做任何改动的高效策略。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
补料分批细胞培养工艺的产量在过去25年间得到了显著的提升，甚至超过了此前最乐观的预测。这种发展得益于化学限定培养的开发，其促进了培养基和补液的设计，以及适用于在工艺相关条件下进行细胞克隆筛选的高通量、小规模培养系统的建立。随着单克隆抗体开始占据生物制药公司的管线，通过对常见关键参数的深入优化，已可建立高滴度工艺。所以，产能的进一步提升，需要另辟蹊径。
大规模细胞培养工艺的强化
在过去，提高滴度的主要因素是综合活细胞密度（IVCD），多年来，IVCD一直在增加，其主要通过两种策略：首先，通过培养基优化，延长生长期，以达到更高的峰细胞密度，以及，第二，通过优化补液和工艺参数，提高活性，从而进一步延长工艺运行。尽管滴度可显著提升，但补料分批运行的持续时间也从几天增加到了几周。为时更长的工艺对于产能来说是一个缺点：同一设备上可进行的运行次数降低了。
高接种密度的概念：分开生长期和生产期
如以缩短高滴度工艺时间为目标，一种非常有应用前景的策略是将低产率的生长期从生产生物反应器转移到N-1种子扩增生物反应器。基本上，目前的补料分批工艺都由包括细胞生长和生产的两阶段工艺组成，目标是达到高产率和产物质量要求。考虑到开始几天细胞生长的任何降低都有可能影响最终的IVCD，且起始生长期过量废弃代谢物的累积会影响整个生产阶段，补料分批的优化极具挑战性：必须在细胞生长和生产之间做出妥协。
在N-1步骤中，引入基于灌流的高密度接种概念，可将生长和生产分开，从而为工艺开发提供多个优势。通过对N-1罐中的条件进行调节，可有利于细胞生长。此外，通过提高灌流速率，可去除废弃代谢物，并通过接种程序进一步稀释。这可确保转移至生产生物反应器的废弃物和降解产物的量最小化，形成有利于补料分批的条件。尽管细胞在开始的几天仍会生长，但不再需要快速的生长，仅需要2次倍增，细胞密度可超过30 x 10^6 cells/mL。所以，从补料分批运行的一开始，生产生物反应器的工艺条件即可关注于滴度和产物质量。
常规补料分批工艺（a）和在N-1步骤中使用灌流的高接种密度补料分批工艺（b）（M.Jordan, et al., 2018）.
用于N-1生物反应器的灌流步骤
高密度接种方法的关键点是将N-1生物反应器中的细胞保持在对数生长期，直到达到所需的细胞密度。明显，N-1步骤获得足够的细胞密度需要使用灌流技术。但是过去很长一段时间来，生产商都倾向于直接的补料分批技术，通过优化补液，可提高补料分批的细胞密度，但种子扩增步骤的优化进展却很少，其通常保持在较低的细胞密度水平，对数细胞生长实际上处于简单的批次工艺。
近年来，行业对灌流的认识发生了变化，现在有可靠的、用于不同规模的可抛弃型细胞截留系统。将交替式切向流（ATF）中空纤维系统连接至生物反应器，可延长悬浮培养的对数生长期。灌流技术作为获得极高细胞密度的首选方法已被广泛接受用于制备高密度冻存细胞库。通过在冻存步骤前，将细胞保持在对数生长期，灌流可确保细胞回收率的最大化以及解冻后成功的生长。
最近，灌流也开始被用于常规的N-1种子扩增步骤。通过提高N-1细胞密度，可使用1:100的比例接种生产生物反应器。以简化接种液制备为目标，有研究人员使用1个20L N-1灌流生物反应器，以常规细胞密度，接种了一个2,000L生物反应器。笔者总结认为，在N-1灌流培养中，可在第6天，达到50 x 10^6 cells/mL的密度，且在补料分批生产中的性能与通过标准种子扩增工艺获得的细胞一样好。此外，已有研究人员将N-1灌流生物反应器中的细胞密度提高到了100 x 10^6 cells/mL，且证实这些细胞与从25或50 x 10^6 cells/mL的N-1生物反应器获得的细胞具有相同的生长潜力。
总结
多年前，行业既已建立了用于补料分批工艺的更高接种密度概念，以缩短工艺时长，同时维持相同的性能，并将该策略用于大规模生产。该策略的优势不仅在于时间方面，将生长期和生产期分为两个不同步骤的方法提供了新的优化可能性，从而进一步提高细胞密度和滴度。
在N-1步骤中引入灌流技术是过去二十年来，种子扩增操作最大的进步。这种改动可为生产工艺的运行提供诸多灵活性。如有必要，可通过调节灌流速率，使N-1罐延长数天，细胞密度可增加十倍，甚至更多。
这种将灌流与随后的补料分批相结合的方法利用了两种工艺的长处，同时为工艺开发创造了新的机会，如当使用灌流作为一种高效的工具，获得了高细胞密度之后，可通过平行运行多个小规模生物反应器，快速优化补料分批。
笔者相信，高密度接种概念不仅在时间上具有吸引力，也有潜力激励优化，以进一步推升生产工艺中的活细胞密度和产物滴度。
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原文：M.Jordan, N.M.Kinnon, V.Monchois, et al., Intensification of larger-scale cell culture processes. Current Opinion in Chemical Engineering, 2018, 22:1-5.
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